Resultaten van het onderzoek tot nu toe! INTRODUCTIE

L-2-hydroxyglutaaracidurie is een relatief zeldzame aangeboren stofwisselingsziekte, waarbij met name L-2-hydroxyglutaarzuur stapelt. Patiënten met dit defect laten een variëteit aan symptomen zien, waaronder ataxie, convulsies, mentale retardatie, en er is in algemene zin een achteruitgang in ontwikkeling. De aard van het onderliggende defect is tot zeer recent onduidelijk gebleven, maar in samenwerking met de groep van Dr. Judith Fischer in Parijs is het gen, geassocieerd met L2-hydroxyglutaaracidurie recent geïdentificeerd (Topcu et al., 2004)waarbij aangegeven dient te worden dat de groep van Van Schaftingen het gen ongeveer tegelijkertijd ook geïdentificeerd heeft (Rzem et al., 2004). Het project kende de volgende 4 doelstellingen:
  1. Opheldering van de vraag wat de precieze enzymatische functie is van het product van het gen, zoals geïdentificeerd door de Parijse groep.
  2. Opheldering van de vraag wat de precieze subcellulaire lokalisatie is van het L2-hydroxyglutaarzuureiwit.
  3. Opheldering van de vraag wat de precieze bron van L-2-hydroxyglutaarzuur is.
  4. Opzetten van diagnostiek voor dit ziektebeeld: zowel enzymatisch als moleculari.

ONDERZOEKSRESULTATEN

1- Het gen, gemuteerd in L2-hydroglutaric aciduria patënten is door Topcu et al. (Topcu et al., 2004) geïdentificeerd. Aan dit onderzoek hebben wij een bijdrage geleverd. Het gen heeft 10 exonen en 9 intronen en codeert voor een eiwit met 463 aminozuren. Gebruikmakend van specifieke primers is het cDNA voor het product van het L2-hydroxyglutaric aciduria gen, genaamd duranine, gekloneerd in een vector, waarbij er tevens voor gezorgd is dat er een zogenaamde "tag" aan het eiwit gezet is om op die manier op een simpele wijze het eiwit te kunnen isoleren. Hierbij is gekozen voor de zogenaamde His-tag, die aanleiding geeft tot een stretch van histidine aminozuren, die voor efficiënte binding aan een nikkelkolom zorgt. De geconstrueerde vector is naar E. coli getransformeerd, waarna gegroeid is op een medium plus en minus IPTG. IPTG is nodig om het cDNA tot expressie te brengen.

Na het groeien van de E. coli stam zijn de supernatanten in eerste instantie geanalyseerd met behulp van SDS/PAGE gel elektroforese, waarbij duidelijk onder invloed van IPTG een eiwit van ongeveer de verwachte grootte aantoonbaar was. Hierna zijn de supernatanten op een nikkelkolom gebracht om aldus het His-getagte duranine in handen te krijgen. Het geïsoleerde His-getagte eiwit werd geëlueerd van de nikkelkolom en bleek inderdaad te corresponderen met het eiwit dat al waargenomen was bij de SDS/PAGE analyse. Het kwam in hoge zuiverheid van de nikkelkolom af (geschatte zuiverheid > 90%).

Het betreffende His-getagte eiwit is gebruikt om de enzymatische karakteristieken vast te stellen. Omdat duranine tot de familie van oxidoreductasen behoort, zoals gebleken is uit het werk van Van Schaftingen et al. (2) en uit het feit dat op basis van het cDNA voorspeld was dat het eiwit een karakteristieke sequentie had, de zogenaamde Rossman-fold, moest het wel om een dehydrogenase gaan die met NAD of NADP zou reageren. Daarom hebben we in eerste instantie onderzocht of het His-getagte eiwit productie van NAD+ naar NADH gaf onder invloed van L2-hydroxyglutaarzuur. Hetzelfde hebben we gedaan met NADP als oxidator. Deze experimenten hebben helaas geen succes gehad. Onder géén van de condities die we getest hebben, waarbij allerlei mogelijke varianten zijn bekeken, onder ander pH, zoutsterkte, aanwezigheid van reducerende agentia, et cetera, is er een conditie gevonden waarbij ófwel NADH ófwel NADPH gevormd werd onder invloed van L2-hydroxyglutaarzuur.

Aangezien het zou kunnen zijn dat L2-hydroxyglutaarzuur niet het substraat is maar juist de co-enzym A ester van L2-hydroxyglutaarzuur, is de betreffende co-enzym A ester ook daadwerkelijk gesynthetiseerd. Ook deze experimenten, waarbij dus L2-hydroxyglutaarzuur vervangen is door de co-enzym A ester, hebben vooralsnog geen resultaat gegeven.

2. Genereren van een antilichaam. De succesvolle expressie van het fusie-eiwit, zoals onder 1 beschreven, kon, ondanks dat het vooralsnog inactief bleek te zijn, wel gebruikt worden om een antilichaam op te wekken. Hiertoe is het His-getagte eiwit in konijnen ingespoten en is op die manier getracht een antilichaam in handen te krijgen. De eerste pogingen hebben geen positieve respons opgeleverd om onduidelijke redenen. We hebben nu opnieuw het eiwit tot expressie gebracht en we hebben nu besloten om het antilichaam commercieel te laten maken door een bedrijf dat grote ervaring heeft met het genereren van antilichamen. We hebben met andere eiwitten goede ervaringen verworven met dit bedrijf en hopen in de naaste toekomst een antilichaam in handen te hebben dat wel aan deze doelstellingen voldoet.

3. Een belangrijke vraag is wat de precieze bron van L2-hydroxyglutaarzuur is. Om dit te achterhalen zijn fibroblasten van controle en L2-hydroxyglutaaracidurie patiënten geïncubeerd in standaard HAM-F10 medium met daaraan foetaal kalfsserum toegevoegd. Uit deze experimenten is duidelijk naar voren gekomen dat L2-hydroxyglutaarzuur verhoogd is in het geval van L2-hydroxyglutaaracidurie patiënten. Weglaten van foetaal kalfsserum leidt ertoe dat het niveau van L2-hydroxyglutaarzuur, zoals gevonden in patiëntenfibroblasten, in ieder geval duidelijk lager was, op basis waarvan geconcludeerd kan worden dat een nog onbekende component, aanwezig in het foetaal kalfsserum, als bron dient voor het L2-hydroglutaarzuur. Wij zullen in de komende tijd trachten te achterhalen welke component dit dan ook is.

4. De beschikbaarheid van het gen, coderend voor L2-hydroxyglutaarzuur maakt moleculaire diagnostiek van L2-hydroxyglutaaracidurie patiënten mogelijk. Hiertoe is genomische analyse van het L2-hydroxyglutaarzuur gen door ons opgezet. De betreffende methode werkt in de praktijk naar volle tevredenheid en is gebruikt om moleculaire diagnostiek in de weinige patiënten waarvan wij materiaal hebben, te volvoeren.
CONCLUSIE
emre-nl

De resultaten, zoals boven beschreven, laten zien dat we in ieder geval vordering hebben gemaakt met betrekking tot verschillende vraagstellingen rond L2-hydroxyglutaaracidurie. Helaas is het vooralsnog niet mogelijk geweest om de precieze functie van het genproduct duranine vast te stellen. Alle pogingen, zoals door ons gedaan om activiteit aan te tonen met L2-hydroxyglutaarzuur of L2-hydroxyglutaryl-CoA als substraat, zijn negatief gebleken. Het tot expressie gebrachte eiwit dat is gebruikt, wordt op dit moment ingezet om een antilichaam te genereren dat binnen afzienbare tijd naar verwachting tot resultaat zal leiden en zowel studimogelijk maakt naar de precieze subcellulaire lokalisatie van het enzym als ook de vraag of het eiwit wel of niet aanwezig is in materiaal van patiënten. Er is ook een voorzichtig begin gemaakt met de opheldering van de vraag wat de precieze bron van L2-hydroxyglutaarzuur is. Een nog onbekende component, aanwezig in kalfsserum, en dus ook waarschijnlijk in humaan serum, is daarvoor verantwoordelijk. Een fractionering van de sera naar de toekomst toe dient te gebeuren om vast te stellen wat deze component dan ook is. Deze experimenten zullen door een van onze analisten gedaan worden. Tenslotte is moleculaire diagnostiek opgezet om de precieze moleculaire aard van het defect bij L2-hydroxyglutaaracidurie patiënten mogelijk te maken.
Prof. dr. Ronald J.A. Wanders 26 april 2006

Hetonderzoek
Het doel

van het onderzoeksproject is :" Het vinden van de oorzaak van de ziekte genaamd: L-2-hydroxyglutaaracidurie".

Achtergronden

L-2-hydroxyglutaaracidurie is een ziektebeeld, waarvoor tot nu toe geen afdoende verklaring en ook geen afdoende behandeling bestaat. De ziekte uit zich als een hersenafwijking, welke bij jonge mensen een ernsti achterstand in de geestelijke ontwikkeling en spasticiteit veroorzaakt.

De naam van de ziekte is ontstaan door de uitscheiding (in de urine) van een stof genaamd L-2-hydroxyglutaarzuur. L-2-hydroxyglutaarzuur wordt bij gezonde mensen niet of nauwelijks gemaakt. Omdat patiënten met de ziekte deze stof uitscheiden ligt het voor de hand dat de verschijnselen met de aanwezigheid van die stof samenhangen. Het is echter niet bekend hoe die samenhang is. Verondersteld wordt dat de ziekte ontstaat door het ontbreken van een nog onbekend enzym, dat onder normale omstandigheden zorgt dat L-2-hydroxyglutaarzuur zich niet in het lichaam ophoopt.

Het doel van dit project is om te zoeken naar de enzymen welke betrokken zijn bij L-2-hydroxyglutaarzuur. In het Lab Genetische Metabole Ziekten van het AMC te Amsterdam (Hoofd van de research- afdeling: Prof.Dr. R.J.A. Wanders) wordt voortdurend gewerkt aan de oplossing van erfelijke stofwisselingsziekten.

Er is hierdoor een erkende expertise op dit gebied aanwezig. Voor een project als het vinden van de oorzaak van L-2-hydroxygltaaracidurie bestaat wel de supervisie en deapparatuur, maar niet de mankracht. Wenselijk i Prof. Wanders voor een periode van één tot twee jaar aan de ontsluiering van de L-2-hydroxyglutaaracidurie te kunnen werken.

De kosten worden voorlopig geraamd op 000 voor de duur van twee jaar.Prof. Dr. P.G. Bart.